Proteomika i metabolomika
Podręcznik dla studentów, doktorantów i pracowników naukowych takich kierunków,
jak chemia, biochemia, biotechnologia i medycyna, a także pracowników przemysłu
farmaceutycznego oraz firm biotechnologicznych.
Proteomika jest nauką zajmującą się badaniem struktury białek oraz zależności
między budową danego białka a sprawowaną przez niego funkcją biologiczną.
Zagadnienia z zakresu proteomiki obejmują rozdzielanie białek oraz ich
sekwencjonowanie z wykorzystaniem nowoczesnych technik badawczych. Istotną część tego
podręcznika poświęcono metabolomice - nowej dziedzinie badań białek i ich funkcji
metabolicznych.
Tę pionierską w Polsce prezentację najnowszych gałęzi nauki przygotowano na
podstawie ostatnich publikacji i opracowań dostępnych w światowej literaturze
przedmiotu.
Cennym uzupełnieniem tej książki jest dysk CD, na którym można
znaleźć podstawowe dane potrzebne w codziennej pracy w laboratorium, m.in. tabele z
zestawem mas aminokwasów i typowych sygnałów pochodzących od zanieczyszczeń próbek.
Podano tu również wykaz ważniejszych adresów internetowych w aktywnej postaci,
umożliwiających błyskawiczne dotarcie do informacji na temat poszczególnych metod i
programów niezbędnych do prowadzenia eksperymentów lub ćwiczeń, a także na
połączenie się z rozmaitymi bazami danych. Na CD znajdują się zarazem wszystkie
zamieszczone w książce ilustracje, a znakomita ich część prezentowana jest w wersji
kolorowej, co pozwala na śledzenie ich na bieżąco podczas lektury książki lub
wykorzystywanie podczas zajęć - dzięki rzutnikom multimedialnym - w dużym
powiększeniu.
. Autorzy
. Słowo wstępne
1. „Omika” i biologia systemów (Jerzy Silberring, Anna Drabik)
2. Wprowadzenie do proteomiki i strategii identyfikacji białek (Anna
Drabik, Jerzy Silberring)
2.1. Wprowadzenie
2.2. Jaka strategia?
2.3. Wybór materiału biologicznego
2.4. Strategie proteomiki
2.5. Wybór strategii
2.6. Proteomika i jej działy
3. Analiza metabolomu – zróżnicowanej chemicznie matrycy (Agnieszka
Kraj)
3.1. Co to jest metabolom ?
3.2. Techniki analityczne i wyzwania ilościowej analizy metabolitów
4. Przygotowanie materiału biologicznego do analizy (Magdalena
Niedziółka)
4.1. Wprowadzenie
4.2. Pobranie i przechowywanie materiału
4.3. Które składniki badanej próbki są ważne?
4.4. Zanieczyszczenia – podstawowy problem analityka
4.5. Separacja i izolacja białek
4.6. Oczyszczanie białek
4.7. Współczesne kierunki badań
5. Chromatografia gazowa w połączeniu ze spektrometrią mas (Hana
Raoof)
5.1. Wprowadzenie
5.2. Zasada działania GC-MS
5.3. Wielowymiarowa metoda GC ??GC-MS
5.4. GC-MS czy LC-MS ?
5.5. Derywatyzacja
5.6. Biblioteki widm i identyfikacja związków na podstawie widma masowego
6. Elektroforeza jednowymiarowa (1-DE) (Anna Drabik, Piotr Laidler)
6.1. Wprowadzenie
6.2. Rozdział elektroforetyczny – zasada działania
6.3. Polimeryzacja żelu poliakrylamidowego (PAGE, ang. Polyacrylamide gel
electrophoresis)
6.4. Przygotowanie próbki
6.5 Elektroforeza w warunkach natywnych (niedenaturujacych, ang. native PAGE)
6.6. Elektroforeza w warunkach denaturujących SDS-PAGE (ang. sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)
6.7. Żel agarozowy
6.8. Tricyna/SDS-PAGE
6.9. Kwas octowy/mocznik PAGE
6.10. Barwienie
6.11. Znakowanie izotopowe
6.12. Przechowywanie wyników
6.13. Wady techniki elektroforetycznej
6.14. Najczęściej popełniane błędy (w 1-DE)
7. Elektroforeza dwuwymiarowa 2-DE (Anna Drabik, Anna
Bodzoń-Kułakowska)
7.1 Wprowadzenie
7.2. Przygotowanie próbki do rozdziału 2-DE
7.3. Pierwszy wymiar – ogniskowanie izoelektryczne (IEF)
7.4. Drugi wymiar w SDS-PAGE
7.5. Analiza komputerowa skanów żeli
7.6. Różnicowa elektroforeza żelowa
7.7. Barwniki fluorescencyjne stosowane w DIGE
7.8. Standard wewnętrzny
7.9. Techniki znakowania stosowane w DIGE
7.10. Podsumowanie
8. Elektroforeza kapilarna (Bogusław Buszewski, Ewa Kłodzińska,
Michał Szumski, Marek Noga, Jerzy Silberring)
8.1. Wprowadzenie
8.2. Elektroforeza kapilarna – podstawy teoretyczne
8.3. Mechanizm rozdzielania w elektroforezie kapilarnej – pojęcia podstawowe
8.4. Sposoby detekcji
9. Ogniskowanie do punktu izoelektrycznego (IEF, ang. isoelectric
focusing) (Anna Drabik)
9.1. Wprowadzenie
9.2. Możliwości zastosowań ogniskowania do punktu izoelektrycznego
10. Spektroskopia Ramana (Małgorzata Barańska, Anna Baran)
10.1. Wprowadzenie
10.2. Aparatura
10.3. Wprowadzenie do analizy aminokwasów, białek i metabolitów
10.4. Specjalne techniki ramanowskie w proteomice i metabolomice
10.5. Mapowanie ramanowskie, RM
11. Bloting białek (Ibeth Guevara-Lora, Anna Gołda, Andrzej Kozik)
11.1. Wprowadzenie
11.2. Transfer białek i peptydów na membranę
11.3. Detekcja
11.4. Przykłady zastosowania blotingu białek w proteomice
12. Electrospray i nanoelectrospray (ESI i nanoESI) (Piotr Suder)
12.1. Wprowadzenie
12.2. Cechy techniki electrospray
12.3. Zasada działania metody ESI
12.4. Modyfikacje źródła jonów typu ESI: nanoelectrospray (nanoESI)
12.5. Modyfikacje źródła jonów typu ESI: DESI (ang. Desorption by electrospray )
12.6. Podstawy analizy widm
13. Chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas (LC-MS)
(Piotr Suder)
13.1. Wprowadzenie
13.2. Rodzaje połączeń LC-ESI-MS
13.3. LC-MALDI-MS
13.4. HPLC vs UPLC
13.5. Wybór kolumny chromatograficznej dla techniki LC-MS
13.6. Chromatografia kapilarna a spektrometria mas
13.7. Interpretacja wyników analiz
14. Wielowymiarowe techniki separacji połączone ze spektrometrią mas
(Marek Noga, Anna Drabik)
14.1. Wprowadzenie
14.2. Zasada działania
14.3. Rozdzielczość systemu chromatograficznego
14.4. Zastosowania układów wielowymiarowych
14.5. Zastosowania
14.6. Kolumny z innymi wypełnieniami
14.7. Połączenia LC-CE
14.8. Zintegrowane układy CE-CE
14.9. Wielowymiarowe techniki
15. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) (Adam
Moszczyński, Magdalena Niedziółka)
15.1. Wprowadzenie
15.2. Matryce
15.3. Nanoszenie próbki
15.4. Analiza widm
15.5. MALDI w analizie i identyfikacji białek
15.6. MALDI a fragmentacja
15.7. MALDI a sekwencjonowanie białek
15.8. Analizator czasu przelotu – TOF oraz TOF/TOF
16. Warianty laserowej desorpcji/jonizacji (Adam Moszczyński)
16.1. SELDI (ang. surface-enhanced laser desorption/ionization)
16.2. Zastosowania SELDI w proteomice
16.3. Powierzchnie wykorzystywane w SELDI
16.4. Układ antygen–przeciwciało (chromatografia powinowactwa)
16.5. LAC (ang. lectin affinity capture)
16.6. Oddziaływania międzycząsteczkowe (ang. biomolecular interactions)
16.7. Oddziaływania hydrofobowe, jonowymieniacze
16.8. MELDI (ang. material-enhanced laser desorption/ionization)
16.9. SALDI (ang. surface-assisted laser desorption/ionization)
16.10. Desorpcja/jonizacja na krzemie (DIOS)
16.11. Węgiel oraz inne materiały
16.12. Nanostruktury
17. Skaningowa spektrometria mas (Małgorzata Iwona Szynkowska, Jerzy
Silberring)
17.1. Wprowadzenie
17.2. Spektrometria mas jonów wtórnych
17.3. Jonizacja/desorpcja laserowa wspomagana matrycą (MALDI)
17.4. Desorpcja/jonizacja laserowa pod ciśnieniem atmosferycznym
17.5. Desorpcja/jonizacja poprzez ESI (DESI)
17.6. Podsumowanie i ogólna charakterystyka metod skaningowych
18. Wysokorozdzielcza spektrometria mas w metabolomice (Agnieszka Kraj)
18.1. Wprowadzenie
18.2. Zasada działania analizatora cyklotronowego rezonansu jonów z transformacją
Fouriera (FT-ICR)
18.3. Wysokorozdzielcza spektrometria mas w metabolomice
18.4. Podsumowanie
19. Techniki izolacji i fragmentacji jonów (Filip Sucharski)
19.1. Wprowadzenie
19.2. Spektrometry masowe
19.3. Metody fragmentacji
19.4. Nomenklatura widm fragmentacyjnych
19.5. Nomenklatura peptydów cyklicznych
20. Identyfikacja białek wspomagana fragmentacją (Marek Noga, Filip
Sucharski)
20.1. Wprowadzenie
20.2. Metoda „odcisku palca” mapy peptydowej
20.3. Identyfikacja peptydów
20.4. Weryfikacja identyfikacji peptydów
20.5. Identyfikacja białek
21. Fragmentacja wspomagana chemicznie (Adam Moszczyński)
21.1. Wprowadzenie
21.2. Dlaczego widma fragmentacyjne białek i peptydów mogą stwarzać problemy
interpretacyjne?
21.3. Co daje derywatyzacja?
21.4. Przykłady derywatyzacji
21.5. Znakowanie peptydów za pomocą 18O
21.6. Acetylacja i deuteroacetylacja
22. Sekwencjonowanie de novo (Filip Sucharski, Adam Moszczyński)
22.1. Wprowadzenie
22.2. Sposób postępowania
22.3. Podstawowy protokół sekwencjonowania de novo
23. Proteomika funkcjonalna (Anna Bodzoń-Kułakowska)
23.1. Wprowadzenie
23.2. Kompleksy białkowe.
23.3. Cele proteomiki funkcjonalnej
23.4. Analiza interakcji
23.5. Wielostopniowe oczyszczanie izolowanego kompleksu
23.6. Oddziaływania białko–DNA
23.7. Badanie interakcji binarnych
23.8. Macierze białkowe i peptydowe
23.9. Drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H, ang. yeast two-hybrid system)
23.10. Metody fluorescencyjne
23.11. Badanie aktywności enzymów (ang. activity-based probes).
23.12. Manipulowanie ekspresją genów
23.13. Techniki komputerowe
23.14. Problemy proteomiki funkcjonalnej
24. Macierze białkowe i peptydowe (Grzegorz Schroeder, Piotr Młynarz,
Anna Czernicka)
24.1. Wprowadzenie
24.2. Mikromacierze diagnostyczne
24.3. Metody funkcjonalizacji powierzchni mikromacierzy
24.4. Synteza ligandów in situ
24.5. Znakowanie cząsteczek
24.6. Metody detekcji
24.7. Biosensory
24.8. Zastosowania mikromacierzy
25. Zastosowanie sieciowania chemicznego w celu badania interakcji między
białkami (Przemysław Mielczarek)
25.1. Wprowadzenie
25.2. Analizy z zastosowaniem czynników sieciujących
25.3. Typy reakcji chemicznych z zastosowaniem czynników sieciujących
25.4. Projektowanie czynników sieciujących
25.5. Zastosowanie spektrometrii mas do analizy białek po reakcji chemicznego sieciowania
25.6. Identyfikacja produktów reakcji chemicznego sieciowania
26. Proteomika strukturalna (Grzegorz Bujacz, Anna Bujacz)
26.1. Wprowadzenie
26.2. Krystalizacja białek
26.3. Charakterystyka kryształów białkowych
26.4. Pomiar dyfrakcyjny
26.5. Rozwiązywanie struktury
26.6. Budowa modelu
26.7. Udokładnianie modelu
26.8. Analiza poprawności struktury
27. Proteomika ilościowa (Marek Noga)
27.1. Wprowadzenie
27.2. Analiza ilościowa na podstawie barwienia żeli
27.3. Analiza ilościowa w wykorzystaniem spektrometrii mas
27.4. Syntetyczne standardy wewnętrzne
27.5. Znakowanie różnicowe
27.6. Znakowanie metaboliczne
27.7. Znakowanie białek
27.8. Znakowanie peptydów
27.9. Znakowanie z wykorzystaniem widm MS/MS
27.10. Metda ilościowa bez znakowania
27.11. Metody półilościowe
27.12. Podsumowanie
28. Proteomika kliniczna (Anna Bodzoń-Kułakowska)
28.1. Wprowadzenie
28.2. Biomarkery
28.3. Strategie proteomiki klinicznej
28.4. Implementacja biomarkera do praktyki klinicznej
28.5. Analiza płynów ustrojowych w proteomice klinicznej
28.6. Analiza tkanki
28.7. Podsumowanie – teoria a praktyka
29. Proteomika modyfikacji potranslacyjnych (Filip Sucharski)
29.1. Wprowadzenie
29.2. Metody badania modyfikacji potranslacyjnych
30. Metabolom człowieka (Agnieszka Kraj)
30.1. Wprowadzenie
30.2. Strategie badania metabolomu
30.3. Wybór platformy analitycznej
30.4. Dobór i przygotowanie próbek
30.5. Dostępne bazy danych metabolitów
31. Metabolom żywności i żywienia (Elżbieta Kostyra, Henryk Kostyra)
31.1. Ewolucja metabolomu żywności i żywienia
31.2. Definicja metabolomu żywności i żywienia
31.3. Podejście systemowe do analizy metabolomu żywności i żywienia
31.4. Metabolom żywności psychoaktywnej
31.5. Interaktywność składników żywności a metabolom żywności i żywienia
31.6. Strategia badań metabolomu żywności i żywienia
32. Metabolom roślinny (Maciej Stobiecki, Piotr Kachlicki)
32.1. Wprowadzenie
32.2. „Omika” funkcjonalna a biologia systemów
32.3. Specyfika analiz metabolomów roślinnych
32.4. Metody analityczne stosowane w badaniach metabolomów roślinnych
32.5. Przykłady badań metabolomów roślinnych
32.6. Materiały uzupełniające
33. Nowe podejście w oznaczaniu i identyfikacji mikroorganizmów (Ewa
Kłodzińska, Michał Szumski,Bogusław Buszewski)
33.1 Wprowadzenie
33.2. Techniki elektromigracyjne, nowe metody detekcji oraz metody biologii molekularnej w
analizie szczepów bakterii S. Aureus
33.3. Rozważania końcowe
34. Metabolom drożdży (Filip Sucharski)
34.1. Wprowadzenie
34.2. Techniki analityczne w analizie metabolomu drożdży
34.3. Perspektywy badań metabolomu drożdży
35. Badania farmakologiczne (Jolanta Kotlińska, Agnieszka Pachuta,
Marcin Bocheński)
35.1. Wprowadzenie
35.2. Badania wstępne
35.3. Testy poszerzone
36. Wstęp do chemii kombinatorycznej (Adam Lesner, Magdalena Wysocka,
Anna Łęgowska, Krzysztof Rolka)
36.1. Chemia kombinatoryczna – historia i perspektywy
36.2. Synteza równoległa – metody tworzenia bibliotek
36.3. Metody syntezy kombinatorycznej
36.4. Biblioteki kodowane
36.5. Wybór polimeru do syntezy bibliotek peptydowych
36.6. Proces wyszukiwania sekwencji aktywnych (dekonwolucja biblioteki peptydowej )
36.7. Zastosowanie chemii kombinatorycznej
37. Bioinformatyka – zarys ogólny (Wojciech Rożek, Paweł Ciborowski)
37.1. Wprowadzenie
37.2. Definicja bioinformatyki
37.3. Biologia systemów i bioinformatyka
37.4. Bazy danych
37.5. Analiza danych
37.6. Walidacja danych
37.7. Powszechne udostępnianie danych – korzyść dla wszystkich
37.8. Organizacja danych
38. Chemometria w metabolomice i proteomice (Beata Walczak, Michał
Daszykowski)
38.1. Wprowadzenie
38.2. Gromadzenie, przetwarzanie i interpretacja danych
39. FRET (Stanisław Wysocki)
39.1. Dlaczego FRET?
39.2. Podstawy fizyczne FRET
39.3. Metodyka pomiaru FRET
39.4. Zastosowanie FRET w badaniach dynamiki molekularnej peptydów i białek
39.5. FRET białek fluorescencyjnych – na tropach białek w komórce
Indeks
40. Laboratorium. Ćwiczenia praktyczne (Adam Moszczyński, Anna Drabik,
Anna Bodzoń-Kułakowska, Hana Raoof, Przemysław Mielczarek)
40.1. Zasady BHP
40.2. Przygotowanie białek rozdzialonych w żelu SDS-PAGE do analizy z zastosowaniem
spektrometrii mas
40.3. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących
(SDS-PAGE)
40.4. Bioinformatyczne narzędzia identyfikacji białek
40.5. Identyfikacja peptydu z wykorzystaniem fragmentacji wspomaganej matrycą w źródle
jonów MALDI
40.6. Zastosowanie metody LC-MS w proteomice
40.7. Kinetyka reakcji enzymatycznych
41. Dodatki: bazy danych, tabele i definicje (Magdalena Niedziółka,
Filip Sucharski, Hana Raoof, Adam Moszczyński)
41.1. Literaturowe bazy danych
41.2. Bioinformatyczne bazy danych
41.3. Tabele
41.4. Definicje: masy i jednostki w spektrometrii mas
560 stron, Format: 19.0x24.5cm.oprawa miękka + CD
