BIOSENSORY DNA DO WYKRYWANIA MIKROORGANIZMÓW CHOROBOTWÓRCZYCH W ŻYWNOŚCI
Celem niniejszej pracy było skonstruowanie elektrochemicznego biosensora DNA
przeznaczonego do wykrywania mikroorganizmów patogennych występujących w żywności
poprzez identyfikację specyficznych dla nich fragmentów kwasów nukleinowych.
Jako docelowy DNA został wybrany fragment genu aerolizyny – toksyny wytwarzanej
przez bakterie Aeromonas hydrophila. Konstrukcja warstwy detekcyjnej opierała się na
wykorzystaniu samoorganizującej się struktury tioorganicznych cząsteczek na powierzchni
elektrody złotej. Warstwę taką stanowiły zmodyfikowane alkilotiolowym łącznikiem
sondy DNA oraz merkaptoalkoholowe cząsteczki strukturotwórczego wypełniacza. System
detekcji reakcji hybrydyzacji został oparty na wykorzystaniu elektrochemicznych
wskaźników różnicujących jedno- i dwuniciowy DNA unieruchomiony na powierzchni
elektrody złotej.
Głównym celem zastosowania gotowego biosensora była analiza jakościowa, tj.
wykrycie bakterii A. hydrophila w próbkach żywności. Opracowany system biodetekcji
umożliwiałby przeprowadzenie oznaczeń ilościowych danego patogenu, jeżeli zapewniona
zostałaby odpowiednia procedura przygotowania próbek.
Wstep
Mikroflora chorobotwórcza w żywności, metody wykrywania. Biosensory
1. Zagrożenie żywności mikroflorą chorobotwórczą
1.1. Skala zagrożeń mikrobiologicznych żywności
1.2. Zatrucia pokarmowe o etiologii bakteryjnej
1.3. Aeromonas hydrophila – charakterystyka zagrożenia
1.4. Metody wykrywania bakterii chorobotwórczych w żywności
2. Biosensory
2.1. Zasada konstrukcji biosensora
2.2. Obecny stan rozwoju technologii biosensorowych
3. Wykorzystanie biosensorów DNA w badaniu żywności
3.1. Biosensory do wykrywania związków chemicznych oddziałujących z dsDNA
3.2. Biosensory do wykrywania specyficznych fragmentów kwasów nukleinowych
3.2.1. Badanie żywności zmodyfikowanej genetycznie
3.2.2. Detekcja mikroflory patogennej
4. Elementy analizy elektrochemicznej w biodetekcji DNA
4.1. Techniki pomiarowe z kontrolowaną zmiana potencjału
4.1.1. Chronoamperometria/chronokulometria
4.1.2. Woltamperometria cykliczna
4.1.3. Woltamperometria fali prostok1tnej
4.2. Elektrochemiczny układ pomiarowy
4.2.1. Środowisko pomiarowe
4.2.2. Elektroda pracująca
4.2.3. Elektroda odniesienia i pomocnicza
4.3. Modyfikacje elektrody pracującej
4.3.1. Samoorganizujące sie monowarstwy
4.3.2. Immobilizacja sond DNA
5. Systemy detekcji hybrydyzacji w elektrochemicznych biosensorach DNA
5.1. Czynniki wpływające na proces hybrydyzacji DNA
5.2. Detekcja procesu hybrydyzacji kwasów nukleinowych
5.2.1. Bezpośrednie metody detekcji hybrydyzacji DNA
5.2.2. Pośrednie metody detekcji hybrydyzacji DNA
Konstrukcja elektrochemicznego biosensora DNA i jego zastosowanie do wykrywania
bakterii Aeromonas hydrophila. Badania własne
1. Materiały i metody
1.1. Aparatura, sprzet i oprogramowanie
1.2. Odczynniki
1.3. Procedury pomiarowe
1.3.1. Wyznaczanie elektrochemicznego pola powierzchni elektrody
1.3.2. Badanie elektrochemicznego efektu blokowania
1.3.3. Pomiar pojemnooeci elektrycznej interfazy elektroda–roztwór elektrolitu
1.3.4. Wyznaczenie ilości DNA unieruchomionego na powierzchni elektrody złotej
1.3.5. Ocena wyników hybrydyzacji z użyciem błekitu metylenowego
1.3.6. Ocena wyników hybrydyzacji z użyciem wskaźnika Hoechst 33258
1.4. Pozostałe procedury
1.4.1. Czyszczenie powierzchni elektrod złotych
1.4.2. Wybór i ocena sond ssDNA
1.4.3. Aktywacja sond ssDNA
1.4.4. Modyfikacja powierzchni elektrod pracujących
1.4.5. Hybrydyzacja w warstwie detekcyjnej biosensora
1.4.6. Izolacja i amplifkacja bakteryjnego DNA
2. Wyniki i dyskusja
2.1. Zaprojektowanie sond ssDNA specyficznych dla genu aerolizyny A. hydrophila
2.2. Przygotowanie elektrody pracującej i ustalenie warunków pomiarów.
2.2.1. Przygotowanie powierzchni elektrod złotych
2.2.2. Charakterystyka buforów wytypowanych do pomiarów elektrochemicznych
2.2.3. Sygnał elektrochemiczny wybranych wskaźników hybrydyzacji DNA
2.3. Modyfikacja powierzchni elektrody złotej – konstrukcja warstwy detekcyjnej
biosensora
2.3.1. Efekt blokowania elektrochemicznego przez monowarstwy SAM
2.3.2. Pojemność elektryczna interfazy miedzy powierzchnia elektrody a roztworem
elektrolitu
2.3.3. Gestość powierzchniowa sond ssDNA w warstwie detekcyjnej biosensora
2.4. Reakcja hybrydyzacji w warstwie detekcyjnej biosensora
2.4.1. Charakterystyka DNA zakumulowanego na powierzchni elektrody pracuj1cej
2.4.2. Wpływ czasu reakcji na wydajność hybrydyzacji
2.4.3. Odpowiedź systemu detekcji hybrydyzacji na zmiane steżenia docelowego DNA
2.4.4. Odpowiedź systemu detekcji hybrydyzacji na obecność niekomplementarnych
fragmentów DNA
2.5. Wykrywanie Aeromonas hydrophila w wodzie pitnej
2.5.1. Detekcja z użyciem wskaźnika błekitu metylenowego
2.5.2. Detekcja z użyciem wskaźnika Hoechst 33258
3. Podsumowanie wyników badan
Wnioski
Bibliografia
Summary
